Конфокальная микроскопия
Метод конфокальной микроскопии сегодня считается одним из наиболее перспективных методов визуализации кожи in vivo, поэтому интерес к нему как среди клиницистов, так и среди представителей научно-исследовательских институтов необычайно высок.
Немного истории
Идея создания микроскопа, способного на клеточном уровне показать прижизненный срез живой ткани, активно разрабатывалась еще 130 лет назад. Основной элемент современных микроскопов был сконструирован в конце XIX века и представлял собой вращающийся диск с мельчайшими отверстиями, расположенными по спирали. Этот диск был изобретен в 1883 г. немецким студентом Паулем Нипковым, в честь которого и получил свое название - диск Нипкова (или нипков-диск). Изобретение было основано на способности света, проходя через мельчайшие отверстия в диске и увеличительную линзу, проникать в глубину ткани и освещать фрагмент клетки на удалении от поверхности. При быстром вращении диска фрагменты складываются в общую картинку. За счет удаления или приближения конструкции к объекту можно варьировать глубину оптического среза исследуемой ткани.
Только с появлением видеомагнитофонов в 1980-х и компьютеров, способных обрабатывать изображения, в начале 1990-х годов появилась реальная возможность создать и эффективно применить те современные микроскопы, которые используются в наше время.
Конфокальная микроскопия для исследования кожи
Конфокальный микроскоп дает две неоценимые возможности - исследование тканей на клеточном уровне в состоянии физиологической жизнедеятельности и демонстрации результатов исследования (т. е. клеточной активности) в четырех измерениях - высота, ширина, глубина и время. Для качества изображения и глубины исследования наиболее важную роль играет способность ткани к пропусканию света, иначе говоря, ее прозрачность. Метод конфокальной микроскопии - бесконтактный, луч света не приносит никакого вреда или дискомфорта обследуемому пациенту или экспериментальному животному.
Для исследования кожи используют конфокальную сканирующую лазерную микроскопию (confocal scanning laser microscopy, CSLM). Метод позволяет увидеть эпидермис и сосочковый слой дермы с разрешением, приближенным к гистологическому. Все результаты обследования отображаются на мониторе и сохраняются в виде пакета файлов с изображениями (в виде микрофильма (в динамике) или микрофотографий).
Имеется две разновидности метода:
- отражательная (reflectance CSLM) - основана на том, что различные внутриклеточные и межклеточные структуры имеют разный индекс преломления света, что позволяет получать контрастное изображение.
- флуоресцентная (fluorescence CSLM) - использует лазерный свет, проникающий в кожу и возбуждающий в ней экзо- или эндохромофоры, которые в ответ начинают излучать фотоны (т. е. флуоресцировать).
Латеральное разрешение - минимальное расстояние между точками, расположенными на горизонтальной плоскости, т.е. плоскости, параллельной поверхности кожи. Аксиальное разрешение - минимальное расстояние между точками, расположенными на плоскости, перпендикулярной поверхности кожи.
Возможности конфокальной микроскопии
В дерматологии конфокальную лазерную микроскопию используют для:
- изучения пенетрации соединений в кожу (путей проникновения, кинетики, распределения в коже);
- наблюдения за работой желез (определение активного и пассивного состояния);
- исследования микроциркуляторного русла (в том числе и в режиме реального времени);
- диагностики новообразований.
Не обсуждая достоинства и недостатки указанных выше разновидностей конфокальной микроскопии, отметим, что в последние годы все бoльшую популярность завоевывает флуоресцентная лазерная конфокальная микроскопия. На рис. V-3-2 – V-3-8 представлены изображения, полученные с ее помощью.
Оптическая когерентная томография
Оптическая когерентная томография (ОКТ) - метод неинвазивного исследования, который все шире применяют в медицине в диагностических целях. В ОКТ используют ближний инфракрасный свет, которым освещают исследуемый участок ткани. Любая биологическая ткань, в том числе кожа и слизистая, состоит из структур различной плотности и поэтому оптически неоднородна. Инфракрасный свет, попадая на границу двух сред с разной плотностью, частично отражается от нее и рассеивается. Анализируя коэффициент обратного рассеяния света, можно получить информацию о строении ткани на данном участке.
Сканируя ткань оптическим лучом, проводят серию осевых измерений в различных поперечных сечениях и направлениях - как аксиальном (в глубину), так и латеральном (боковом). Мощный компьютер, встроенный в ОКТ-систему, обрабатывает полученные числовые данные и рисует двухмерное изображение (своего рода "морфологический срез"), удобное для визуальной оценки.
ОКТ представляет интерес для клинического использования по ряду причин. Разрешающая способность ОКТ составляет 10–15 мкм, что практически на порядок превышает разрешение других диагностических методов, в том числе ультразвукового. Такое высокое разрешение позволяет изучать архитектуру ткани. Информация, получаемая с помощью ОКТ, является прижизненной и отражает не только структуру, но и особенности функционального состояния тканей. Метод ОКТ неинвазивен, поскольку использует излучение в ближнем инфракрасном диапазоне с мощностью порядка 1 мВт, которое не оказывает повреждающего воздействия на организм. Метод исключает травму и не имеет ограничений, присущих традиционной биопсии.
